為了探明無機(jī)鹽穩(wěn)定化脂肪酶的潛在機(jī)理，該文以小麥胚芽脂肪酶為研究對象，基于界面酶學(xué)的分析方法，研究添加濃度介于1.0×10-9～1.0×10-2mol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+的氯化物對小麥胚芽脂肪酶存在的油-水界面特性的影響。結(jié)果表明，當(dāng)小麥胚芽脂肪酶體系濃度為1.7×10-6mol/L時(shí)，一價(jià)金屬中Na+更有利于抑制油-水界面的表面張力（P＜0.05），對麥胚脂肪酶存在時(shí)的油水界面特性影響也較大；二價(jià)金屬離子Ca2+對界面張力的影響趨勢與一價(jià)離子不同，在高濃度時(shí)反而增加界面張力；當(dāng)油水界面上存在脂肪酶的催化底物（三油酸甘油酯）和產(chǎn)物（油酸）時(shí)，添加濃度分別為10-6、10-6、10-4和10-9mol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+均可一定程度上降低油水界面張力，從而降低麥胚脂肪酶的作用效果，三油酸甘油酯存在時(shí)Mg2+的作用效果最明顯（P＜0.05），油酸存在時(shí)Na+的作用效果最明顯（P＜0.05）。綜上，無機(jī)鹽金屬離子主要通過影響麥胚脂肪酶在油水界面的聚集行為及底物結(jié)構(gòu)狀態(tài)起到鈍化麥胚脂肪酶的作用，該結(jié)果可為麥胚脂肪酶存在時(shí)界面的活性調(diào)控及麥胚的穩(wěn)定化處理提供參考。

0引言

小麥胚芽是小麥加工的主要副產(chǎn)物之一，約占整個(gè)小麥籽粒的2.5%～3.0%。小麥胚芽營養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“人類營養(yǎng)的天然寶庫”。全球每年5.5億t小麥產(chǎn)量中，大約可產(chǎn)出100萬t功能性油脂和300萬t蛋白質(zhì)，但目前有效利用率卻不足10%，主要是因?yàn)樾←溑哐恐泻胸S富的脂肪酶，在其作用下脂肪極易水解，導(dǎo)致小麥胚芽的酸敗變質(zhì)，為此，小麥胚芽穩(wěn)定化是當(dāng)前備受關(guān)注的課題。

小麥胚芽脂肪酶（LA，lipase A）是一種兩親性且具有界面活性的蛋白分子，只能作用于油水界面，該界面不僅是LA催化反應(yīng)的關(guān)鍵場所，也是調(diào)控LA催化活性的合適位點(diǎn)。多年來，學(xué)界關(guān)于油水界面的理解一直局限于所謂“界面性質(zhì)”的模糊認(rèn)識(shí)，并推測脂肪酶與底物之間的相互作用可能包括靜電吸引，底物的取向性和水合作用等。直到最近，Reis應(yīng)用生物物理學(xué)理論，才首次揭開了界面微環(huán)境與脂肪酶催化活性的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。事實(shí)上，脂類酶促水解是典型的多相催化反應(yīng)，其反應(yīng)速率和方向取決于界面微環(huán)境的所有組成成分。界面組成所呈現(xiàn)出的特征及其與酶催化效率的關(guān)聯(lián)性，不僅為今后研究脂肪酶界面催化反應(yīng)提供了新方法，也為研究麥胚脂肪酶的鈍化方法開辟了新的途徑。

研究表明，全麥粉中添加一定量Na+，可抑制76.7%脂肪酶活力；Na+對膜結(jié)合脂肪酶活力抑制率達(dá)55%，由此可見，加入金屬離子抑制劑可作為鈍化LA的輔助手段。此外，LA本身并不能決定酶促反應(yīng)的平衡常數(shù)，其催化水解效率依賴于LA的界面活性以及底物、產(chǎn)物以及抑制劑在界面的擴(kuò)散速率與動(dòng)態(tài)分布。Torcello-Gómez等研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子可與離子化脂肪酸特異性形成某種復(fù)合物，改變脂肪酸溶解性和油水界面的某些性質(zhì)，進(jìn)而影響脂肪酶催化活性。因此，在無機(jī)鹽作用下，LA所處微環(huán)境發(fā)生改變，勢必影響界面層（水相）對LA的吸附和底物在界面層（油相）的定位。此外，各種界面活性分子也會(huì)在界面層產(chǎn)生競爭，如甘油三酯水解產(chǎn)生具有界面活性的二酰甘油、單酰甘油等會(huì)占據(jù)界面層與LA分子發(fā)生競爭，或者通過分子間相互作用使LA構(gòu)象發(fā)生變化。上述兩種作用機(jī)制都可能對LA的催化效果產(chǎn)生影響。因此，對油水界面特性的深入研究與充分認(rèn)識(shí)，將有助于發(fā)現(xiàn)新的LA活力調(diào)控方式。

目前，有關(guān)金屬離子對LA影響作用的研究中，一般涉及無機(jī)鹽對LA活性、結(jié)構(gòu)等影響方面的研究，而金屬離子是否會(huì)對麥胚LA存在時(shí)油水界面特性產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響LA的催化活性尚停留在推斷階段?；谏鲜霈F(xiàn)狀，本研究基于界面酶學(xué)分析方法，研究不同濃度的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2對麥胚LA、麥胚LA+三油酸甘油酯和麥胚LA+油酸3種不同油水界面模型的影響，以期從界面特性角度分析Na+、K+、Ca2+、Mg2+4種金屬離子對麥胚LA催化功能的影響機(jī)制，為小麥胚芽穩(wěn)定化方法的建立提供理論研究依據(jù)。

1、材料與方法

1.1材料與儀器

麥胚LA（產(chǎn)品編號(hào)L3001）、單油酸甘油酯，購自美國Sigma有限公司；癸烷，純度99%，購自英國Alfa Aesar A Johnson Matthey公司；油酸、三油酸甘油酯、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2均為分析純，購自上海國藥化學(xué)試劑有限公司。

界面張力儀，芬蘭Kibron公司；AR-G2旋轉(zhuǎn)流變儀，美國TA Instruments公司；ED-F12標(biāo)準(zhǔn)型加熱水浴槽循環(huán)器，德國Julabo公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1界面張力測定

采用吊片法測定麥胚LA油水界面的張力。界面張力結(jié)果為3次測量的平均值，試驗(yàn)溫度為25.0±0.1℃。計(jì)算公式如下：

F=mg+2γ(L+d)cosθ（1）

式中F為鉑片所受拉力，N，m為鉑片質(zhì)量，kg；g為重力加速度，m/s2；L為鉑片長度，m；d為鉑片厚度，m；γ為表面張力，N/m；θ為接觸角，(°)。由于d＜＜L，所以F=mg+2γLcosθ。

1.2.2界面流變性質(zhì)的測定

利用配有Du Nouy環(huán)系統(tǒng)的AR-G2旋轉(zhuǎn)流變儀進(jìn)行測定，具體操作如下：1）將20 mL磷酸鹽緩沖溶液加入樣品杯；2）把盤放置在珀?duì)栙N平板上的定位環(huán)內(nèi)；3）降下機(jī)頭直至環(huán)定位與液體上表面的平面；4）將約5 mL癸烷均勻地加入到水樣表面，至完全浸沒Du Nouy環(huán)；5）在振蕩模式下，選擇“Strain sweep step”，測試頻率為1Hz時(shí)，油水界面的流變性質(zhì)，選擇G'（儲(chǔ)能模量）和G''（損耗模量）呈線性變化區(qū)間內(nèi)的應(yīng)變（strain）值，進(jìn)行后續(xù)測定。選擇“Frequency sweep step”，測試25℃、特定Strain下、頻率0.1～3 Hz區(qū)間內(nèi)16個(gè)點(diǎn)的界面流變性質(zhì)；6）程序設(shè)定完成后，測定界面剪切彈性模量和界面剪切黏度等。

1.2.3不同濃度麥胚LA存在的界面模型構(gòu)建

以癸烷為油相、0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH值=7.0）為水相，建立油水界面模型，同時(shí)分別添加1.70×10-8～1.70×10-6mol/L的麥胚LA到水相，研究不同濃度的麥胚LA對油水界面張力和界面流變特性的影響。

1.2.4不同種類與濃度的無機(jī)鹽對麥胚LA界面特性的影響

以NaCl、KCl、CaCl2、MgCl24種無機(jī)鹽的形式向油水界面模型水相中分別添加4種金屬離子，研究濃度介于1.0×10-9～1.0×10-2mol/L間的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2對麥胚LA界面張力和界面流變特性的影響。

1.2.5不同濃度三油酸甘油酯對界面組成與結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)1.2.3的試驗(yàn)結(jié)果，固定磷酸鹽緩沖溶液中麥胚LA濃度，設(shè)定油水界面模型油相中三油酸甘油酯的濃度分別為1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3和1×10-2mol/L，分別按照1.2.1、1.2.2中的方法測定界面張力、界面流變參數(shù)。分析不同濃度三油酸甘油酯對油水界面組成與結(jié)構(gòu)的影響。

1.2.6不同濃度水解產(chǎn)物（油酸）對界面組成與結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)1.2.3的試驗(yàn)結(jié)果，固定磷酸鹽緩沖溶液中麥胚LA濃度，設(shè)定油水界面模型油相中油酸的濃度為5×10-6、5×10-5、5×10-4、5×10-3、5×10-2和5×10-1mol/L，分別按照1.2.1、1.2.2中的方法測定界面張力、界面流變參數(shù)。分析不同濃度水解產(chǎn)物對油水界面組成與結(jié)構(gòu)的影響。

1.2.7底物或產(chǎn)物存在時(shí)，無機(jī)鹽對麥胚LA界面特性的影響

參考1.2.3的試驗(yàn)結(jié)果，在每種無機(jī)鹽的不同研究濃度范圍內(nèi)，選取對麥胚LA界面張力和界面流變性質(zhì)影響較大的某一濃度，同時(shí)按照1.2.5、1.2.6的試驗(yàn)結(jié)果，選取對界面特性影響最大時(shí)的三油酸甘油酯和油酸的濃度，研究有底物或產(chǎn)物存在時(shí)，NaCl、KCl、CaCl2、MgCl24種無機(jī)鹽對麥胚LA界面張力和界面流變特性的影響。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)測定結(jié)果的平均值。采用Minitab進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)間差異性以95%置信區(qū)間（P＜0.05）來說明。