酶周轉(zhuǎn)數(shù)（kcat）是了解細胞代謝、蛋白質(zhì)組分配和生理多樣性的關(guān)鍵，但實驗測量的kcat數(shù)據(jù)往往稀疏且嘈雜。

查爾姆斯理工大學(xué)（Chalmers University of Technology）的研究團隊提供了一種深度學(xué)習(xí)方法（DLKcat），用于僅根據(jù)底物結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)序列對來自任何生物體的代謝酶進行高通量kcat預(yù)測。DLKcat可以捕獲突變酶的kcat變化并識別對kcat值有強烈影響的氨基酸殘基。研究人員應(yīng)用這種方法來預(yù)測300多種酵母物種的基因組規(guī)模kcat值。

此外，該團隊設(shè)計了一個貝葉斯管道，以根據(jù)預(yù)測的kcat值參數(shù)化酶約束的基因組規(guī)模代謝模型。由此產(chǎn)生的模型在預(yù)測表型和蛋白質(zhì)組方面優(yōu)于先前管道中相應(yīng)的原始酶約束基因組規(guī)模代謝模型，并使研究人員能夠解釋表型差異。DLKcat和酶約束的基因組規(guī)模代謝模型構(gòu)建管道是揭示酶動力學(xué)和生理多樣性的全球趨勢，并進一步闡明大規(guī)模細胞代謝的寶貴工具。

該研究以「Deep learning-based kcat prediction enables improved enzyme-constrained model reconstruction」為題，于2022年6月16日發(fā)布在《Nature Catalysis》。

酶轉(zhuǎn)換數(shù)（kcat）定義了反應(yīng)的最大化學(xué)轉(zhuǎn)化率，是了解特定生物體的新陳代謝、蛋白質(zhì)組分配、生長和生理學(xué)的關(guān)鍵參數(shù)。酶數(shù)據(jù)庫BRENDA和SABIO-RK中有大量可用的kcat值集合，然而，與現(xiàn)有的各種生物體和代謝酶相比，這些值仍然稀少，這主要是因為缺乏用于kcat測量的高通量方法。

此外，由于不同的測定條件（例如pH值、輔因子可用性和實驗方法），實驗測量的kcat值具有相當(dāng)大的可變性。總之，稀疏的收集和相當(dāng)大的噪聲限制了kcat數(shù)據(jù)在全局分析中的使用，并可能掩蓋酶進化趨勢。

特別是酶約束的基因組規(guī)模代謝模型（ecGEM），其中全細胞代謝網(wǎng)絡(luò)受到酶催化能力的約束，因此能夠準(zhǔn)確模擬最大生長能力、代謝變化和蛋白質(zhì)組分配，特別依賴于基因組-縮放kcat值。在過去的十年中，ecGEM（或遵循酶約束概念的模型）已分別針對幾種經(jīng)過充分研究的生物體開發(fā)，包括大腸桿菌、釀酒酵母、中國倉鼠卵巢細胞和智人。由于kcat測量的局限性和依賴酶委員會（EC）編號注釋來搜索這些已開發(fā)管道中的kcat值，為研究較少的生物體重建ecGEM或為多種生物體進行大規(guī)模重建仍然是一個挑戰(zhàn)。

此外，即使對于那些經(jīng)過充分研究的生物，kcat的覆蓋范圍也遠未完成。在釀酒酵母ecGEM中，只有5%的酶促反應(yīng)在BRENDA中具有完全匹配的kcat值。當(dāng)數(shù)據(jù)缺失時，以前的ecGEM重建流程通常假設(shè)kcat值來自類似的底物、反應(yīng)或其他生物，這可能導(dǎo)致模型預(yù)測偏離實驗觀察。明確要求獲得大規(guī)模的kcat值以提高模型準(zhǔn)確性并產(chǎn)生更可靠的表型模擬。

深度學(xué)習(xí)已被應(yīng)用并在模擬化學(xué)空間、基因表達、酶相關(guān)參數(shù)（如酶親和力和EC數(shù)）方面表現(xiàn)出出色的性能。此前，有研究人員采用機器學(xué)習(xí)方法，根據(jù)從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中獲得的平均代謝通量和催化位點等特征來預(yù)測大腸桿菌kcat值。然而，這些特征通常很難獲得，這使得這種方法只能應(yīng)用于研究最充分的生物體，如大腸桿菌。

在這里，查爾姆斯理工大學(xué)（Chalmers University of Technology）的研究團隊提出了深度學(xué)習(xí)方法DLKcat來預(yù)測所有代謝酶與其底物的kcat值，只需要底物SMILES信息和酶的蛋白質(zhì)序列作為輸入，從而為任何物種產(chǎn)生通用的kcat預(yù)測工具。

圖示：用于ecGEM參數(shù)化的kcat深度學(xué)習(xí)。（來源：論文）

DLKcat可以捕獲kcat向精確的單個氨基酸替代方向的變化，從而能夠計算注意力權(quán)重，從而識別對酶活性產(chǎn)生重大影響的氨基酸殘基。氨基酸取代是酶進化領(lǐng)域的一項強大技術(shù)，通常用于探測酶催化機制。特別是，大多數(shù)替代實驗在底物結(jié)合位點區(qū)域進行誘變，因為假設(shè)結(jié)合區(qū)域?qū)Υ呋钚援a(chǎn)生很大影響。然而，據(jù)報道，偏遠地區(qū)會對催化活性產(chǎn)生深遠影響。

研究人員不僅確定了人PNP酶肌苷結(jié)合區(qū)域中氨基酸殘基的高關(guān)注權(quán)重，而且還確定了具有高關(guān)注權(quán)重的各種非結(jié)合殘基位點，這表明這些殘基也可能對催化活性產(chǎn)生重大影響，值得進一步驗證。DLKcat因此可以作為蛋白質(zhì)工程工具箱的重要組成部分。

預(yù)測的基因組規(guī)模的kcat譜可以促進酶約束代謝模型的重建，從策劃和自動生成的基本（非ec）GEM中。事實證明，深度學(xué)習(xí)預(yù)測的kcat過程比匹配來自BRENDA和SABIO-RK數(shù)據(jù)庫的體外kcat值更全面但仍然實用；這在GECKO和MOMENT等原始ecGEM重建管道中很常見。

通過不依賴EC編號注釋，DLKcat還能夠預(yù)測同工酶特異性kcat值，而SMILES的使用避免了原始ecGEM重建管道可能遇到的GEM和BRENDA之間底物命名不統(tǒng)一的問題。隨后可以通過貝葉斯方法將DL-ecGEM調(diào)整為現(xiàn)有的實驗生長數(shù)據(jù)，該方法產(chǎn)生具有生理相關(guān)解空間的后均值ecGEM。結(jié)合起來，當(dāng)前基于DLKcat的管道因此適用于幾乎任何生物體的ecGEM重建，其中蛋白質(zhì)序列FASTA文件和基本GEM可用。他們的管道因此提高了適用性，與以前構(gòu)建的原始ecGEM相比，它甚至提高了具有酶促約束的反應(yīng)數(shù)量。

圖示：kcat預(yù)測的深度學(xué)習(xí)模型性能。（來源：論文）

盡管基于DLKcat的管道產(chǎn)生的ecGEM性能優(yōu)于原始ecGEM，但仍然存在各種挑戰(zhàn)。例如，雖然深度學(xué)習(xí)模型可以將混雜酶的替代物與隨機選擇的底物區(qū)分開來，但它仍然預(yù)測了可能過高的隨機底物的動力學(xué)活性水平。

這種行為可以通過負面數(shù)據(jù)的有限可用性來解釋：酶-底物對沒有產(chǎn)生催化作用的情況。增加對陰性數(shù)據(jù)集的報告，其中酶-底物對的未檢測到的活性由酶數(shù)據(jù)庫報告和收集，可以增強未來深度學(xué)習(xí)模型在定義真陰性方面的能力。

此外，DLKcat并未考慮pH和溫度等環(huán)境因素的影響，但將DLKcat與其他新興機器學(xué)習(xí)工具（例如酶的最佳溫度預(yù)測）相結(jié)合，將有助于未來研究環(huán)境參數(shù)對酶活性的影響。

另一個挑戰(zhàn)涉及涉及多種底物和由異聚酶復(fù)合物催化的反應(yīng)。可以為此類反應(yīng)定義的多底物SMILES和蛋白質(zhì)序列都可以與DLKcat一起發(fā)揮作用，從而為一個反應(yīng)產(chǎn)生多個預(yù)測的kcat值。目前在這些情況下，研究人員會選擇最大kcat值，但最好設(shè)計一種方法來預(yù)測每種多底物和異聚酶的一個kcat值。

圖示：用于預(yù)測和解釋突變酶kcat的深度學(xué)習(xí)模型。（來源：論文）

此外，DLKcat衍生的DL-ecGEM和后驗均值ecGEM繼承了基本GEM的局限性，其中基于約束的建模的核心穩(wěn)態(tài)假設(shè)允許人們確定代謝通量，但不容易考慮調(diào)節(jié)行為。雖然ecGEM極大地將基于約束的模型的解空間減少到細胞可行容量，但kcat并不是決定反應(yīng)速率的唯一動力學(xué)參數(shù)，例如，親和常數(shù)起著重要的作用。然而，由于基于約束的模型無法預(yù)測內(nèi)部代謝物濃度，因此目前無法輕易考慮這些參數(shù)的影響。

盡管如此，kcat值也是其他資源分配模型中的重要參數(shù)，例如蛋白質(zhì)組約束的GEM和代謝/大分子表達模型。盡管改進的預(yù)測和更多的應(yīng)用，如何定義kcat值也仍然是重建這些模型的挑戰(zhàn)。這種資源分配模型和ecGEM都認為細胞需要將其有限的蛋白質(zhì)組分配到不同的途徑以實現(xiàn)更快的生長或更好的適應(yīng)度，而每個反應(yīng)的蛋白質(zhì)組成本同樣由酶的通量和動力學(xué)速率定義。

因此，這些模型的代謝部分的深度學(xué)習(xí)預(yù)測kcat值可以提高其質(zhì)量和性能，盡管無法從DLKcat獲得在這些模型公式中確定的其他具有挑戰(zhàn)性的動力學(xué)參數(shù)，例如核糖體催化率。此外，特別關(guān)注描述酶動力學(xué)的模型公式可以受益于深度學(xué)習(xí)預(yù)測的kcat值，因此DLKcat方法可以在建模領(lǐng)域找到廣泛的應(yīng)用。

總之，DLKcat產(chǎn)生了現(xiàn)實的kcat值，可用于指導(dǎo)未來的基因工程、了解酶進化和重建ecGEM以預(yù)測代謝通量和表型。除此之外，這種基于深度學(xué)習(xí)的kcat預(yù)測工具的許多其他潛在用途，例如基因組挖掘和全基因組關(guān)聯(lián)研究分析中的工具。開發(fā)的自動貝葉斯ecGEM重建管道將有助于進一步用于ecGEM重建，用于組學(xué)數(shù)據(jù)合并和分析。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41929-022-00798-z